AZ31镁合金表面Zn-Ca-P涂层的体外血液相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

表面涂层：是在固体表面涂覆一层或多层不同材料的薄膜，来达到强化表面或使表面具有特殊功能的目的。

血液相容性：在医用材料研究中，生物相容性评价是最基本的环节，也是对材料进入人体后的安全性重要保障。血液相容性是生物相容性的一部分，主要研究材料与血液接触后对血液的影响，包括血液成分及功能的改变，即是否引起溶血、凝血等，常用检验材料血液相容性的试验有溶血率的测定、动态凝血时间的测定、血小板黏附情况的观察等。

摘要

背景：前期研究已在AZ31镁合金表面成功制备了Zn-Ca-P涂层，并研究了其抗腐蚀能力。

目的：分析AZ31镁合金表面Zn-Ca-P涂层的血液相容性。

方法：采用化学转化法在AZ31镁合金表面制备Zn-Ca-P涂层，采用扫描电镜观察涂层形貌，X射线衍射分析其成分，通过血小板黏附实验、动态凝血时间实验、溶血实验评价涂层的血液相容性。

结果与结论：电镜观察显示，在AZ31镁合金表面形成一层花样或层状结构的涂层，其化学组成主要为不溶性磷酸盐Zn₃(PO₄)₂•4H₂O。AZ31镁合金Zn-Ca-P涂层表面黏附少量血小板，呈类圆形，无变形与伪足生成；动态凝血时间实验中，Zn-Ca-P涂层曲线经历时间长，呈缓慢向下倾斜形状，表现出更优的抗凝血性能；Zn-Ca-P涂层的溶血率低于5%。结果表明，AZ31镁合金表面Zn-Ca-P涂层具有良好的血液相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0002-0860-9975(王庆昭)

关键词: 生物材料, 材料相容性, AZ31镁合金, Zn-Ca-P涂层, 材料表面, 血液相容性

Abstract:

BACKGROUND: In our previous studies, zinc-calcium-phosphate (Zn-Ca-P) coating has been successfully prepared on the surface of AZ31 magnesium alloy, which improves the corrosion resistance of the alloy.

OBJECTIVE: To analyze the hemocompatibility of Zn-Ca-P coated AZ31 magnesium alloy in vitro.

METHODS: Zn-Ca-P coating was prepared on the surface of AZ31 magnesium alloy using chemical transformation. Afterwards, the characteristics of the Zn-Ca-P coating were investigated using scanning electron microscope, and X-ray diffraction analyzed its components. Besides, hemocompatibility in vitro was evaluated by platelet adhesion assay, dynamic clotting time test and hemolysis test.

RESULTS AND CONCLUSION: Under scanning electron microscope, a flower-like coating was formed ont surface of the AZ31 magnesium alloy, with the main chemical component of insoluble phosphates Zn₃(PO4)₂•4H₂O. And some round distortionless blood platelets adhered to the surface of AZ31 magnesium alloy, with no pseudopodia. In dynamic clotting time test, the long curve of Zn-Ca-P coating tended to descend indicating better anticoagulant activity. And the hemolysis rate was below 5%. In conclusion, Zn-Ca-P coating has good hemocompatibility in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Alloys, Materials Testing, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

2.1 Zn-Ca-P涂层形貌与成分分析扫描电镜显示，Zn-Ca-P涂层呈片层状、花瓣状分布在基体表面，涂层表面有少量微孔，见图1A，B。能谱分析显示，涂层主要由O、Zn、P、Ca和少量Mg组成，见图1C，说明在AZ31镁合金表面成功制备了Zn-Ca-P涂层。X射线衍射图谱显示，镁合金Zn-Ca-P涂层主要由Mg、Zn、Ca、O、P等组成，可能的化合物为Ca(PO₃)₂、Zn₃(PO₄)₂等，见图2。

2.2 血小板黏附实验结果血小板黏附实验常用来检验评价材料抗凝血性能^[39-40]。血液在体外与镁合金表面接触后，有时会激活外源性凝血过程^[41]。无论是AZ31镁合金还是含Zn-Ca-P涂层AZ31镁合金表面都吸附了少量的血小板，均呈类圆形，无明显变形，无伪足生成，见图3A，C；能谱分析其含C、O、S、P等有机成分，见图3B，D。因此血小板黏附实验结果表明，含Zn-Ca-P涂层的AZ31镁合金具有较好的血液相容性。

2.3 体外动态凝血时间实验结果体外动态凝血时间可以间接检测内源性凝血因子被激活的程度，判断材料抗内源性凝血的能力^[42]，反映血液在材料表面的凝固趋势和凝血时间的长短。血液与材料接触连续增加的时间段内测定冲洗液的吸光度值越高，材料的体外动态凝血时间曲线越平缓，说明材料与血液接触后凝血因子被激活的程度越低，材料的血液相容性越好。为了比较不同材料的抗凝血性能，人为定义纵坐标吸光度值为 0.100 时的时间为材料的凝血时间。

AZ31镁合金比含Zn-Ca-P涂层AZ31镁合金的动态凝血曲线下降陡峭，与血液接触50 min时，AZ31镁合金冲洗液吸光值达到0.1，凝血时间为50 min；含Zn-Ca-P涂层AZ31镁合金直到120 min吸光值仍未达到0.1，见图4，说明含Zn-Ca-P涂层镁合金的凝血因子被激活的程度低，因此证明Zn-Ca-P涂层后的AZ31镁合金血液相容性更好。

2.4 溶血实验结果溶血实验是评价材料血液相容性的常用指标，血液相容性好的医用材料应具有较低的溶血率(小于5%)^[43-44]。实验中以测定545 nm波长处的吸光度值来计算溶血率。

AZ31镁合金的溶血率为(18.67±0.84)%，远远超出医用材料所规定的溶血要求；含Zn-Ca-P涂层AZ31镁合金的溶血率为(4.47±0.13)%，小于5%，满足对生物材料的溶血率要求。由此可知，经过Zn-Ca-P涂层后AZ31镁合金的溶血率降低明显，血液相容性较好。

对于AZ31镁合金处理前后溶血率的变化，分析机制可能为：未进行表面处理的AZ31镁合金和血液接触后，材料局部腐蚀，产生的镁离子，提高了血液的渗透压，导致红细胞膜的破裂，造成溶血。当对AZ31镁合金进行Zn-Ca-P涂层后，AZ31镁合金的抗腐蚀性能显著提高，当其和血液相接触时，材料的降解减慢，进入血液的镁离子减少，红细胞的破裂减少，溶血率下降。

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引言

与传统的永久性植入材料不锈钢、钛合金相比较，镁合金的密度、弹性模量等指标与人体骨骼十分接近，有着传统材料无法比拟的优点。首先，镁离子是人体中重要的阳离子，参与骨骼肌的兴奋性传导及体内许多酶的代谢活动，不会对人体产生危害^[1-5]；其次，过多的镁离子通过肾脏代谢，不会在体内蓄积；再次，镁合金在体内存在大量氯离子的环境中发生降解，避免了二次手术的伤害及传统材料长期存在体内导致的局部炎症、血栓等并发症^[6-9]，因此镁合金成为骨植入材料领域的研究热点^[10-13]。但镁合金作为骨植入材料的研究及应用过程中却有一个致命的弱点，就是降解速度比骨愈合速度快，如何控制其降解速度、提高生物相容性尤为重要^[14-16]。

目前提高镁合金耐蚀性、控制降解速度的方法有：提高镁合金纯度；添加合金元素如Li^[17]、Sn^[18]、Y及Sr等^[19-21]；镁合金表面改性等，尤其通过表面改性在镁合金表面生成具有耐蚀性的膜，延缓镁合金的降解，越来越受到研究人员的重视。常用的表面改性方法有：一是金属涂层，包括电镀层^[22]，在镀液中加入缓蚀剂，缓蚀剂与镁作用，在镁合金表面生成不溶解的保护膜、化学镀层，镁合金化学镀镍^[23]；二是有机涂层，种类繁多，如油漆、蜡、塑料、环氧树脂及各种有机聚合物^[24]；三是转化膜，包括无机、有机转化膜^[25]、阳极氧化膜^[26]、化学氧化膜等。前两种在工业上应用较多，提高镁合金表面的耐磨性、耐腐蚀性、光泽性、装饰性，用于医学领域有些会对机体产生毒害；而化学转化膜具有操作简单易行、成本低等优点被广泛应用，它采用化学或电化学方法在金属表面形成金属氧化物、铬酸盐、磷酸盐或其他与表面化学结合的化合物。镁合金转化膜类型主要有铬酸盐系^[27]、锡酸盐系^[28]、稀土盐系和磷酸盐系等^[29-30]。在镁合金磷酸盐转化膜研究领域，周婉秋等^[31]分析了锰系磷酸盐转化膜的组成及形成机制；Kouisni^[32-33]和Niu等^[34]分析了锌系磷化膜的成膜机制、影响因素。课题在AZ31镁合金表面制备钙锌系磷化膜，即Zn-Ca-P涂层，目前对钙锌系磷转化膜研究的较少。钙、锌均为人体必须的阳离子，对骨骼、肌肉及各种代谢活动起着重要作用。有研究表明，AZ31镁合金Ca-P涂层不仅可提高镁合金的耐蚀性，而且可促进MG63细胞的黏附、增殖及分化；课题将这两种元素加入磷酸盐制备磷化膜，以期达到控制镁合金降解及提高生物相容性两大目的。课题组前期利用化学沉积法在镁合金表面成功制备了Zn-Ca-P涂层，对制备条件、成分分析及在模拟体液中的抗腐蚀能力进行了研究^[35-38]，结果表明Zn-Ca-P涂层显著提高了镁合金的抗腐蚀能力。课题组在前期研究的基础上对镁合金Zn-Ca-P涂层的血液相容性进行研究。

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材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点于2014年10月至2015年5月在山东科技大学生物工程实验室完成。

1.3 材料所用镁合金由中国重庆科学制镁产业科技公司金属研究所研制。将尺寸为2.0 cm×2.0 cm×0.5 cm的镁合金依次用360#、600#、800#、1 000#、1 200#的水磨砂纸打磨，并用冷风吹干，然后碱洗10 min，去除油污，酸处理3 min，活化，吹干备用。扫描电子显微镜自带能谱仪(Nova Nano SEM 450，美国)；X衍射仪(D/MAX-2500/PC，RigaKu)。

1.4 实验方法

1.4.1 Zn-Ca-P涂层的制备取Na₂HPO₄ 20 g/L、NaNO₂ 4 g/L、Zn(NO₃)₂ 4 g/L、NaF 1 g/L、Ca(NO₃)₂ 2 g/L、蒸馏水1 000 mL，配制磷化液，硝酸调pH值为3。将实验准备好的镁合金材料置于磷化液中，55 ℃浸泡20 min，取出晾干。采用扫描电子显微镜对Zn-Ca-P涂层表面形貌进行观察，并借助扫描电子显微镜能谱仪进行成分分析。利用X射线衍射仪对表面物相进行分析。

1.4.2 血小板黏附实验将新鲜抗凝人血(实验室人员自愿捐献，符合伦理要求)1 000 r/min离心10 min，取上层，得富集血小板血浆。将AZ31镁合金和含Zn-Ca-P涂层镁合金各3个平行样置于洁净滤纸上，移取20 µL富集血小板血浆置于上述样品表面，36 ℃恒温箱中保温 30 min，取出后用PBS(pH=7.4)清洗，除去样品表面自由的血小板；2.5%戊二醛中固定30 min，去离子水清洗；依次用体积分数30%、50%、70%、90%、100%的梯度乙醇溶液脱水10 min；晾干后，扫描电镜观察血小板是否黏附在材料上，黏附上的血小板是否变形，如果出现血小板黏附数量多、变性明显，有伪足等，说明材料有促进凝血的作用，血液相容性差，反之，说明材料血液相容性好。

1.4.3 动态凝血时间实验将AZ31镁合金和含Zn- Ca-P涂层镁合金分成6组(5，20，35，50，90，130 min)，每组3个，置于滤纸上，分别取30 µL抗凝人血，滴在样品表面；每组到达相应的时间后，立即放入盛有15 mL去离子水的烧杯中，静置10 min，在540 nm波长处测定吸光值，再以时间为横坐标、以A值为纵坐标，绘制动态凝血时间曲线。

1.4.4 溶血实验

材料浸提液的制备：取2 cm×2 cm×0.4 cm的AZ31镁合金、含Zn-Ca-P涂层镁合金各4块，按照ISO10993-1标准(试样表面积/浸提介质)3 cm²/1 mL的比例，37 ℃恒温箱中静置浸提30 min，浸提介质为生理盐水。取出材料，浸提液过滤除菌后，4 ℃冰箱保存备用。

2%红细胞悬液的制备：取新鲜人血(实验室人员自愿捐献)4 mL，1 500 r/min离心10 min，取上清液，将沉淀的红细胞用PBS洗涤3次，至上清液不显黄色为止。将所得红细胞用PBS配成2%混悬液(红细胞2 mL，加PBS至50 mL)，备用。

实验分组：分别将9 mLAZ31镁合金浸提液、9 mL含Zn-Ca-P涂层镁合金浸提液、9 mL PBS(阴性对照组)和9 mL 蒸馏水(阳性对照组)置入离心管中，每管加稀释人血1 mL，混匀后置37 ℃培养箱孵育1 h，1 500 r/min离心10 min，吸取上清(红色透明)，在波长545 nm处测吸光值(A)，取平均值，计算溶血率。溶血率(%)=(实验组A值-阴性对照组A值)/(阳性对照组A值-阴性对照组A值)×100%。医用材料溶血率要求低于5%。

1.5 主要观察指标采用电镜观察涂层形貌，X射线衍射分析其成分，通过血小板黏附实验、动态凝血时间实验、溶血实验评价涂层的血液相容性。

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讨论

通过化学沉积法在AZ31镁合金表面成功制备了Zn-Ca-P涂层，电镜下Zn-Ca-P涂层呈片层状、花状交错分布，涂层表面有微孔存在。分析其成膜机制是化学-电化学联合机制，其中以电化学反应为主，同时存在镁的溶解及磷化膜沉淀两大反应，首先在转化初期，镁合金表面发生阳极的溶解，有氢气产生即析氢反应，同时在酸性条件下(pH=3.0)，磷酸根发生水解生成H₂PO₄⁻。随着镁的溶解，镁合金表面pH值升高，不溶性磷酸盐Zn₃(PO₄)₂•4H₂O沉积在镁合金表面，形成保护性涂层^[34]。在锌系磷化液引入钙离子，得到的镁合金表面转化膜形貌基本大致相同，但膜层晶粒变得比较细小，成片层状、花瓣状，这表明钙离子起到细化膜层的作用。膜层晶粒越均匀、致密，其耐蚀性就越好。涂层主要由 O、P、Zn、Ca、Mg 元素组成，主要相组成为Zn₃(PO₄)₂•4H₂O。在X射线衍射的检测中，Zn-Ca-P涂层样品在32左右Mg的峰消失，其余的Mg峰存在或出现不同程度的降低，可能为化学沉积制备过程中涂层沉积厚薄不均匀所致。

血液相容性实验表明，黏附在Zn-Ca-P涂层的血小板是呈类圆形，相较于AZ31镁合金，数量极少，且血小板形态较完整；经Zn-Ca-P涂层后的AZ31镁合金溶血率低于5%，对血细胞无明显影响；动态凝血时间实验中，Zn-Ca-P涂层曲线经历时间长，呈缓慢向下倾斜形状，表现出更优的抗凝血性能。通过上述研究表明AZ31镁合金表面Zn-Ca-P涂层具有较好的体外血液相容性。但评估其是否能作为具有良好生物相容性的医用植入材料应用，尚需进一步进行细胞相容性及组织相容性研究，另外作者也看到化学沉积法制备的Zn-Ca-P涂层也有一定缺点：一是涂层与基体的结合力较低，将来作为医用植入材料置入人体，在人体体液环境中很可能出现涂层脱落等问题；二是涂层的厚度不好掌握。

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